循环肿瘤细胞检测的临床应用及其面临的挑战和对策
本文来源：中华病理学杂志, 2022,51(3) : 276-280.DOI：10.3760/cma.j.cn112151-20210804-00550
本文引用：马春辉, 张丽娟, 胡海旭, 等.循环肿瘤细胞检测的临床应用及其面临的挑战和对策 .
摘要
循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTC）是肿瘤发生远处转移的关键环节，也是肿瘤液体活检的主要材料之一，在肿瘤患者的预后判断、疗效预测、疗效评价以及复发转移和耐药机制的研究中都具有重要的临床意义。然而，由于CTC的稀有性、异质性以及转移过程的复杂性等原因，CTC检测的临床应用仍然面临诸多挑战，需要采取行之有效的应对策略予以解决。本文对上述内容进行了综述。
恶性肿瘤是导致我国居民死亡的主要疾病类型［1］，而90%以上的恶性肿瘤死亡都是由远处转移造成的。肿瘤的远处转移大致可以分为4个阶段：肿瘤细胞突破血管屏障进入血液循环；在血液循环系统中存活；突破血管屏障进入特定的组织部位；增殖并最终形成转移灶。其中，突破血管屏障之后在血液循环系统中存活的肿瘤细胞被称为循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTC），这是一个具有异质性的群体，它们彼此之间在细胞大小和形态、分子表型、活性程度、转移潜能、增殖潜能等各个方面可能都有所不同。CTC可能以单个细胞的形式存在，也可能是彼此之间或者与血液来源的细胞聚集在一起形成微小的多细胞聚集体（即循环肿瘤微栓，circulating tumor microemboli），它们是形成肿瘤转移的“种子”，也是认识肿瘤恶性行为的重要窗口［2,3,4］。本文将对CTC检测的临床应用及其面临的挑战和对策进行综述。
01CTC检测的临床应用
作为恶性肿瘤远处转移的关键环节，CTC在患者血液中出现与否及其数量多少，一方面代表了原发肿瘤浸润进入血管的能力，另一方面代表了在远端器官形成转移灶的可能性。因此，检测并计数CTC的数量可以提示肿瘤的恶性程度及转移风险，具有重要的预后价值。此外，CTC还是“液体活检”的重要组成部分，能够弥补难以动态获取肿瘤组织的不足，通过对其进行实时的分子分型和功能分型，更精准地指导对患者的个体化治疗［2］。
CTC检测在临床中的具体应用场景包括高危人群的早期筛查、确诊患者的准确分期、早期患者术后的复发转移监测、晚期患者治疗开始之前的预后判断及每个周期治疗结束之后的疗效评价、分子靶点（如EGFR、HER2、ALK等）的实时分析预测相关药物疗效等，能够为患者的全程管理提供重要的帮助。然而，上述应用场景的临床证据级别却各不相同，比如高危人群的早期筛查虽然备受关注，但是目前并没有大样本人群长期随访的数据；关于确诊患者的准确分期，美国癌症联合委员会（AJCC）的《肿瘤分期指南》已经明确指出，通过CTC的检测可以在无远处转移（M0）和有远处转移（M1）之间引入一个cM0（i+）分期，从而使患者的治疗更为精准；关于早期患者的复发转移监测和分子靶点的实时分析，目前虽然有一些研究报道，但是多中心的前瞻性临床研究比较缺乏，证据级别还不足以改变现有的临床实践；而关于晚期患者的预后判断和疗效评价，目前已经积累了大量的循证医学证据，是CTC最经典的临床应用［5, 6］。总之，对于CTC的临床应用我们应该抱有一种谨慎的乐观态度，要根据临床证据的更新情况适时地调整具体的使用策略。
另外，在基础研究方面，CTC是探索很多关键问题的重要材料来源，其中包括上皮间质转换和间质上皮转换的分子机制、循环肿瘤干细胞的表型特征和功能鉴定、耐药机制及药物敏感性分析、CTC休眠和命运决定的鉴别标志、循环肿瘤微栓的形成原因和作用机制等。这些问题的回答将会有助于我们理解CTC在肿瘤发生发展过程中的具体作用，促进CTC检测方法的优化改进，并且为未来的药物研发或者预防/抑制策略的制定提供重要依据［5, 6］。
02CTC与循环肿瘤DNA的比较
同样作为液体活检的重要材料，CTC和循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）经常被拿来进行比较。二者各具优势，可以互为补充，分别从不同的侧面来反映肿瘤的特征，综合两方面的信息可以为患者的整个病程提供更加全面的认识［7, 8］。
ctDNA的优势是分布广泛且相对均一，对应的数字PCR或者二代测序技术已经非常成熟，而且灵敏度足以胜任。但是ctDNA片段化较为严重，所以相关检测只能局限在点突变、扩增和缺失、易位以及甲基化等。另外，由于缺乏细胞形态的支持，我们很难将肿瘤来源的ctDNA和正常细胞来源的游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）区分开来，所以在检测结果为阴性时还需要保持足够的谨慎［9, 10］。
CTC的优势是具有完整的细胞形态，胞内物质在细胞膜的包裹之下保存的较为完整。哪怕是只有单个细胞，也会具有完整的基因组、转录组、蛋白质组，以及侵袭、增殖和转移的潜能。所以在CTC上的检测内容会更为丰富，结果的可信度更高，除了可以覆盖ctDNA的所有检测之外，还可以进行mRNA的相关检测，染色体层面的缺失、扩增和融合检测，以及计数、形态观察、蛋白表达和功能研究等［11, 12］。但是CTC检测的问题在于缺乏公认的可靠技术，如何获得数量和质量都能满足下游分析要求的CTC是相关工作得以开展的先决条件。在目前及今后相当长的一段时间内，这都是影响整个领域发展的瓶颈。
03CTC检测技术的基本原理
外周血中的CTC数量非常稀少，106~107个白细胞中才会有1个CTC。因此，CTC检测首先需要根据其生物学或物理学特性进行富集，然后再根据CTC的基因表达或功能特点对富集到的细胞进行鉴定［13, 14］。
CTC富集的主要目的是优化产出和纯度，实现基础和临床应用的最大化，主要策略可以分为基于亲和性和基于非亲和性两大类。基于亲和性的富集技术是目前使用最为广泛的CTC富集手段，主要利用CTC和白细胞上差异表达的独特抗原来实现，包括采用表达于CTC而不表达于白细胞上的抗原［如上皮黏附蛋白（EpCAM）］进行阳性富集，以及采用表达于白细胞而不表达于CTC上的抗原（如CD45）进行间接的阴性富集。而基于非亲和性的富集主要利用了CTC和白细胞在细胞大小、密度、离心力、电荷特性等方面的差异来实现，如微孔过滤法、惯性芯片技术、密度梯度离心法以及介电电泳等。这些方法的特异性虽然不及亲和性富集技术，但是所获得的细胞群体更为全面，这将有助于CTC异质性的分析［11, 12, 13, 14］。
CTC的鉴定策略主要有表型鉴定和功能鉴定两种。采用荧光标记的抗体检测特异蛋白的表达是最常用的表型鉴定手段（如采用细胞角蛋白进行阳性鉴定，采用CD45排除白细胞，并采用DAPI染色细胞核），其优势是可以直接看到细胞，但不足之处是图像扫描和判读比较费时费力，而且容易受到主观因素的影响。此外，也可以通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测上皮特异（如细胞角蛋白19）或者组织特异（如乳腺珠蛋白）来源的mRNA来进行表型鉴定，这种方法成本较低，有成熟的质控体系，能够进行多指标的定量分析，可以进行自动化处理，结果相对客观，但也存在看不到细胞形态，无法进行后续功能分析等缺点。通过特定蛋白的分泌、凝胶侵袭实验、端粒酶活性检测以及动物移植模型等方式进行的功能鉴定是确认CTC的终极标准，能够排除一些特殊情况所导致的假阳性结果，但是这些方法往往需要经过一段时间的细胞体外培养，耗时较长，操作复杂，难以提高通量，所以一般不适合临床常规诊疗流程，而是更多的应用于功能性的基础研究［11, 12, 13, 14］。
04CTC检测技术所面临的挑战和对策
依托上文所介绍的富集鉴定策略，目前已经形成了几十种各不相同的商业化CTC检测体系［11, 12, 13, 14］。然而遗憾的是，这些方法都存在某种程度的不足，并没有在临床实践中得到大规模的推广应用。为了更好地满足临床需求，未来的CTC检测技术必须面临如下挑战并找到合适的应对之策。
1.更高的富集效率：只有尽可能多的捕获CTC的完整群体，后续所获得的信息才会更加全面和可信。然而，有相当比例的晚期患者检测不到CTC或者CTC的数量不足以完成下游的分析，这说明检测方法的富集效率还有待提高。也有研究者在尝试省略富集的步骤，这必须借助更为敏感的数字RT-PCR技术或者高分辨率的图像扫描技术，目前的应用并不广泛［15］。影响富集效率的原因可能有多个，相应的解决策略也有所不同。首先，作为最常用的富集手段，依赖单一抗体EpCAM的阳性分选是导致富集效率不高的重要原因之一。这是因为肿瘤在转移过程中会发生上皮间质转化现象，由上皮细胞特征转换为间质细胞特征，这部分细胞会因为EpCAM的表达降低或者缺失而被漏检［16］。针对该问题，一些技术尝试采用多个抗体的组合或者采用CD45阴性分选来解决；也有一些新技术选择了不依赖抗原表达的非亲和性方法。然而，CTC群体的异质性可能远超我们的想象，而每一种富集方法也并非完美无缺，因此近年来的一种新趋势是采用多种富集手段的联合，实现彼此之间的优势互补，进一步提高富集效率，但是过长的处理步骤也可能会影响CTC的活性。未来也许可能还有新的CTC富集策略，但是这要建立在对CTC生物学特性有进一步认识的基础之上［15］。其次，粗放式的操作可能是导致富集效率不高的另外一个原因。如在经典的CellSearch系统中，富集和荧光标记步骤都是在15 mL的离心管中进行，期间还会反复冲洗，这难免会造成不必要的细胞损失。精细化的微流控芯片是解决这一问题的可行方案，这些芯片一般只有普通载玻片大小，一次可以处理1~2 mL血样，发生损耗的概率相对更小，而且可以极大节省试剂支出和成本［17, 18］。然而，检测血量过低也会影响检测的效果，一方面是因为其中的CTC数目相对有限，另一方面是因为检测的采血量一般仅占人体正常血液量的0.1%左右，由此所带来的采样误差将会影响各个批次检测之间的可比性。通过增加采血量来提高检出率并不可行，因为不仅患者难以接受，后续的处理也会增加很多的负担，难以提高检测通量。在这种情况之下，体内检测可能是一种潜在的解决方案，比如CellCollector技术就是将EpCAM包被的金属丝插入到患者的肘静脉血管中进行CTC收集，静置30 min处理的血量可以达到1 500 mL，远远高于体外检测的血量，检出率优于传统的CellSearch系统［19］。此外，动物实验的结果提示，持续的体外循环富集所获得的CTC数量要明显高于单次采样的结果［20, 21］，但是这种操作在人体中的安全性和可靠性还有待进一步的验证。
2.特异的鉴定策略：外周血中白细胞的数量众多，即使经过CTC富集之后仍然会有大量残留，因此必须通过特异的方法对CTC进行鉴定。在现有的方法之中，表型鉴定是一种即时检测，但是难免会出现假阳性和假阴性的结果；功能鉴定的特异性更好，但是耗时较长，不适合在临床常规开展。近期有研究者提出通过葡萄糖摄取实验来进行CTC的鉴定，其原理跟PET-CT类似，通过代谢能力的差异来判断目的细胞的良恶性，该方法既能够像常规表型鉴定一样进行即时检测，又能够反映目的细胞的功能特点，如果能够得到更多临床数据的验证，未来将具有良好的应用前景［22］。这个方法也提示我们，制定特异的鉴定策略需要充分了解CTC的生物学特性，这也是CTC基础研究领域的重要职责之一。
3.自动化和标准化：自动化和标准化主要包括样品处理和图像扫描分析两个方面。其中，样品处理涉及自动化设备的研发、操作流程和技术参数（包括离心转速、孵育时间、加样量等）的锁定、试剂和耗材（包括体积、浓度、抗体克隆号、材质、生产厂家等）的统一、全程质控和故障排查方案等，这些环节是避免人为影响因素的干扰，保证检测结果可比性的必要手段。目前，不少新技术已经在做这方面的努力并且获得了不错的效果。然而，自动化的图像扫描分析系统依然是很多检测方法的软肋，只是依靠人工进行操作和分析不仅费时费力，而且容易漏检。一个可靠的图像扫描分析系统不仅需要更高性能的显微镜来提高图像的质量，还需要反复优化并锁定荧光标记抗体的浓度以及对应的曝光时间，需要研发配套的软件和算法进行显微镜的自动调焦、目的细胞的坐标定位以及智能识别和判读等［15］。这方面的工作是CTC检测技术未来开发的难点，必须依赖生物学、光学、机械力学以及软件开发和人工智能等领域的深度交叉融合才能有望实现突破。
4.单细胞的捕获：我们现在越来越清楚地认识到，CTC是一个异质性的群体，其中具有干细胞表型或者转移增殖潜能的只是一小部分细胞，如果只做整个群体的笼统分析，这些细胞的信息将会被错失掉，为避免这种情况，需要采用能够了解每一个细胞特征的单细胞分析技术［23, 24］。目前在肿瘤组织中所采用的单细胞测序技术（如10X genomics）通过“条码（barcode）”为每一个细胞设定一个唯一的标签，可以实现高达数千个细胞的高通量检测［25］。然而，由于CTC的数量相对稀少，上述技术并不适合，一方面是因为按照单个细胞折算下来价格昂贵，另一方面是细胞群体太少将会影响其区分。关于CTC的单细胞分析，首先需要实现单个细胞的捕获和回收，目前采用的方法包括显微镜下的手动吸取、载玻片上的显微切割、通过“陷阱”或“微钩”之类的方式为目的细胞确定坐标定位然后进行自动捕获，以及将细胞形成液流或单细胞微滴之后通过荧光信号或电荷信号进行分选等。而拿到单个细胞之后，还需要进行全基因组扩增（whole-genome amplification），目前常用的方法包括多重置换扩增（multiple displacement amplification）和基于多重退火和环化的扩增循环（multiple annealing and looping-based amplification cycles）［26］。总的来说，CTC单细胞分析的技术门槛较高，一般需要结合高性能的显微镜进行细胞的确认，耗时耗力，也很难提升检测通量，目前更多还是用于基础研究领域。
5.CTC的体外培养：CTC的体外培养是对其进行功能分析，研究肿瘤转移和耐药机制的必要手段［27］，而相关的研究结果反过来又可以推动CTC检测技术的改进和提高。但是体外培养并不是一件容易的事情，即使是人类原发肿瘤也只有在极少数情况下才能够建立起可以连续传代的细胞系。对于CTC来说，这会更具有挑战性，因为CTC体外培养的建立必须同时满足两个前提条件，二者缺一不可。首先是要有合适的技术能够富集到足够数量的活CTC，之前文献报道成功建立体外培养的CTC数值是1 109个和509个/7.5 mL外周血［2］，现有的很多CTC检测技术都无法实现这一点。其次，需要创造一个合适的培养条件，能够在体外有效的刺激和支持CTC的生长，但是目前为止，我们对于这些培养条件的具体细节还缺乏必要的了解。对于第一个条件来说，目前最为矛盾的一点就是，用于捕获CTC的最好的方法要么需要做细胞固定，要么需要使细胞承受较高的剪切力，这些都会导致细胞活性的减少；相反，能够最好地保留细胞活性的方法在富集CTC时的效率和效果并不好。如何平衡细胞活性和CTC的有效捕获是CTC的检测技术不得不面对的棘手挑战。对于第二个条件来说，一般需要添加一些刺激上皮细胞生长的因子，可以采用贴壁培养、无血清悬浮培养以及添加滋养层细胞进行共培养等方式。尽管这些方法被证实是可行的，但是总体来说成功率并不高，而且在很大程度上要依赖所富集的CTC的数量和活性，比如进展期的患者就更容易成功［2］。近期，有研究报道可以采用类器官的培养方式来进行CTC的培养，通过添加特殊的细胞外基质材料，在添加了生长因子的常规培养条件下即可以维持细胞长时间的存活，这可能是未来CTC培养的一个发展方向［28］。
6.循证医学证据和监管审批：CTC检测在临床没有得到广泛应用的关键原因之一是缺乏循证医学的证据，难以通过监管部门的准入审批。目前唯一通过美国和我国监管部门审批的只有CellSearch系统，这不仅是因为该系统的操作规范标准，结果的可比性很好，更重要的是由此保障了多中心临床研究的开展。这些研究设计严谨，随访数据规范翔实，证据级别很高，对临床实践具有重要的指导价值。然而，很多新型的CTC检测技术在临床研究方面是非常欠缺的，仅仅完成某些患者的测试只能证实相关技术的基本性能，距离真正的临床应用还相去甚远。此外，关于采用CTC的实时伴随诊断，目前还缺乏公认的判读标准，未来也需要结合大样本的临床研究来加以确立并不断地对其进行修正［2］。这些多中心的临床研究是一个非常艰难和漫长的过程，对于任何CTC技术的研发企业来说都是一项巨大的负担，但是对于整个行业的发展来说也是一个不得不面对的挑战，因为只有这样才能积累足够可靠的循证医学证据，最终获得临床的准入。
05总结及展望
CTC与肿瘤进展之间紧密的联系使其成为临床和基础研究关注的热点，它不仅对于患者的临床治疗具有重要的指导作用，还是了解远处转移发生发展过程的窗口。然而，在一个半世纪的不懈努力后，CTC的检测技术仍然难以令人满意，一方面可能是因为转移的过程非常复杂，我们目前对它的了解程度还远远不够，而CTC的稀有性和异质性都对其检测提出了巨大的挑战，即使能够捕获到一些CTC，也难以保证它们在离开了体内的环境之后不会发生变化；另一方面可能是因为CTC的检测过程需要涉及材料、化学、生物、物理、电子、光学、微流控、患者管理、人工智能、软件开发、机械自动化等各个方面的专业知识，任何一个单一知识背景的团队都很难胜任它的开发过程，必须依赖多个专业团队的密切协作才可以实现。
目前，国内外有很多已经商业化的检测方法，这些方法各有优缺点，也还在不断地进行优化和改良，现在还很难说具体哪一种是最好的。随着CTC研究的不断深入，我们越来越清楚地认识到，每一种CTC检测技术都有其优势和不足，而CTC的应用需求则是多样化的，不同的需求可能需要选择具有针对性的检测技术。对于每一项具体的检测技术来说，人们往往对它寄予厚望，希望一个方法可以解决所有的问题。但更为实际的做法是在保证检测流程规范化和标准化的基础之上，找准最能发挥该方法优势的临床问题，不断积累足够的循证医学证据。唯有如此，CTC检测方可在临床中发挥其真正的价值。
利益冲突所有作者声明无利益冲突
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