肿瘤标志物在卵巢癌诊断中的研究进展
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作者：王兴国 徐智阳 刘淑娟 邢金良
作者单位：空军军医大学第一附属医院妇产科；空军军医大学基础医学院生理与病理生理教研室
来源：中国癌症防治杂志，2022年2月第14卷第1期
卵巢癌是妇科三大常见的恶性肿瘤之一，在全球范围内发病率居妇科恶性肿瘤第三位，死亡率居第二位。卵巢癌目前尚缺乏有效的早期筛查手段，且发病隐匿，早期症状不明显，因此75%的患者确诊时已处于晚期，5年生存率仅为39%。早期患者5年生存率可达71%~93%。在目前的临床实践中，血清糖类抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）、人类附睾蛋白4 （human epididymis protein，HE4）等传统肿瘤标志物检测对辅助卵巢癌诊断及判断肿瘤的治疗效果具有重要意义。但传统标志物在敏感度和特异度两方面都无法满足早期诊断的要求，因而在卵巢癌早期筛查中仍具有一定的局限性。近年来，一种利用人体体液作为标本来源检测获取肿瘤相关信息的技术——液体活检技术为卵巢癌的早期诊断研究开辟了新方向。液体活检分析的分子标志物包括循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）、循环肿瘤RNA（circulating tumor RNA，ctRNA）、循环肿瘤DNA （circulating tumor DNA，ctDNA）、肿瘤培养的血小板（tumor educated platelet，TEP）等。目前，不断涌现的新型生物标志物为卵巢癌的早期诊断检测提供了更多检测靶标。本文就肿瘤标志物在卵巢癌诊断中的研究进展作一综述。
01
传统卵巢癌标志物
1.1 CA125
CA125是一种由氨基酸端、结构域和羧基端三部分构成的表达于各类上皮细胞表面的高分子量糖蛋白，全长179 kb，定位于染色体19p13.2。CA125被认为是监测卵巢癌最重要的生物标志物之一，灵敏度较高，但特异度欠佳。研究显示，血清CA125预测卵巢癌的平均灵敏度为81.4%（95%CI：74.6%~84.2%）、平均特异度为56.8%（95%CI：47.9%~65.4%）。RADU等报道CA125在卵巢癌早期检测中敏感度较低，其中约50%的Ⅰ期患者血清CA125水平在正常范围内。此外，还有研究显示，在月经、妊娠早期或伴有子宫腺肌症、子宫内膜异位症等状态下，血清CA125水平也可能升高，因此假阳性率也较高。尽管血清CA125检测在临床上有一定局限性，但目前CA125仍是筛查早期卵巢癌的主要血清标志物，且许多临床研究提出的早诊检测组合均是基于血清CA125检测，因此血清CA125检测仍是卵巢癌生物标志物研究的基石。
1.2 HE4
HE4最初从人附睾上皮细胞中分离出来，是一种由WFDC2基因编码的分泌型糖蛋白，相对分子量为25 kDa，定位于染色体20q12~13.1。HE4作为一种新的生物标志物，目前已用于卵巢癌诊断。HE4在卵巢癌组织中特异性高表达，尤其在子宫内膜样腺癌中100%表达，但在正常卵巢组织中不表达。一项纳入17项研究包含3 404例患者的荟萃分析显示，HE4预测卵巢癌的平均灵敏度为79.4%（95%CI：74.1%~83.8%）、平均特异度为84.1%（95%CI：79.6%~87.8%），特异度显著高于CA125。此外，不同于CA125的高假阳性率，HE4因不受怀孕或月经周期影响，在伴子宫内膜异位症或其他良性卵巢肿瘤患者血液中也不会升高，是绝经前妇女较理想的生物标志物。但是，HE4并非全能。研究显示，HE4在卵巢癌中的表达因肿瘤组织学亚型不同而相差很大，在子宫内膜样腺癌中100%表达，而在黏液性腺癌中不表达。同时，HE4的检测特异性同样未达到100%，其在子宫内膜癌中也有较高阳性率。因此，HE4在卵巢癌筛查诊断中的应用依然存在较大的局限性。
目前越来越多的学者提出，联合其他指标监测可提高卵巢癌诊断的灵敏度和特异度。现今也已经开发了多种基于血清CA125和（或）HE4水平并结合患者绝经状态等指标预测可疑良性卵巢肿瘤患者患卵巢癌风险的评估模型并表现出了良好的诊断价值，如卵巢癌风险算法（risk of ovarian malignancy algorithm，ROMA）、恶性风险指数（risk of malignancy index，RMI）、哥本哈根指数（Copenhagen index，CPH-I）等，尤其ROMA已被纳入《卵巢恶性肿瘤诊断与治疗指南》。有研究报道，血清HE4、CA125和ROMA指数联合是诊断绝经后卵巢癌的最佳组合。RMI、CPH-I与ROMA在卵巢癌诊断上具有同等的效能。总之，CA125与HE4的联合检测以及在此基础上ROMA指数的模型计算是目前临床上最简单高效的卵巢癌早期筛查手段之一。
02
新型卵巢癌标志物
2.1 CTCs
CTCs是一种从肿瘤原发灶或转移灶脱落后进入外周血液循环并存活的肿瘤细胞，与肿瘤转移和增殖密切相关。CTCs有三个特点：一是含量低，在大多数癌症患者中，每10 mL血液仅有1~10个CTCs；二是半衰期短，仅为1.0～2.4 h；三是肿瘤早期可检测到，在常规临床诊断前即可发现。这些特点也决定了CTCs对富集检测技术要求极高，且CTCs检测结果具有较强的时效性和预知性。
CTCs检测技术主要由CTCs分离富集技术和CTCs鉴定技术构成。CTCs分离富集技术主要包括密度梯度离心和免疫磁性分离法。CTCs鉴定技术主要包括免疫组织化学技术（IHC）、实时荧光聚合酶链式反应（RT-PCR）、荧光原位杂交技术（FISH）。PEARL等通过自创的基于细胞黏附基质的功能富集平台和IHC法分析129例术前卵巢癌患者CTCs，结果CTCs检出率为88.6%，诊断卵巢癌的灵敏度为83%、阳性预测值（positive predictive value，PPV）为97.3%，CTCs诊断Ⅰ~Ⅱ期卵巢癌的灵敏度为41.2%，特异度为95.1%，PPV为77.8%。为提高CTCs对早期卵巢癌的诊断效能，ZHANG等采用EpCAM、HER2和MUC1的免疫磁性分离富集方法，并结合多重RT-PCR检测109例卵巢癌患者外周血中的CTCs，结果也发现早期（ⅠA~ⅠB期）卵巢癌患者的CTCs阳性率为93%，而CA125 阳性率仅为64%。因此认为，CTCs是卵巢癌诊断的潜在生物标志物。
2.2 ctRNA
2.2.1 血浆及外泌体微小RNA 微小RNA（miRNA）是内源性表达的单链非编码RNA，长度为19~25 nt。研究发现，血清中的miRNA主要集中在外泌体中。外泌体可以将mRNA、miRNA、蛋白质等物质从它们的起源细胞运送到细胞外空间，从而参与调节其他细胞的病理生理功能，因此外泌体被认为是细胞间通讯的一种形式。此外，miRNA还能与载体蛋白或高密度脂蛋白结合，或被包裹在外泌体中，从而免受循环中核糖核酸酶的影响，因此在体液中稳定表达。而miRNA表达的特异性及稳定性使其具有成为卵巢癌早期诊断生物标志物的潜力。目前已有多种外泌体miRNAs被发现与卵巢癌有关，如miR-200a、miR-26a可能参与卵巢癌细胞增殖，miR-21-3p、miR-125b-5p、miR-181d-5p和miR-205等能促进卵巢癌细胞侵袭和转移。外泌体miR-1290在诊断卵巢癌中也表现了一定敏感性，特异度和灵敏度分别为85%和63%。但是，由于组织学的多样性和个体差异性，miRNAs组合往往较单一的miRNA诊断准确性更高。如ZHENG等发现miR-205和let-7f组合在上皮性卵巢癌早期诊断中具有较高的准确性（AUC为0.89）。YOKOI等基于10种miRNAs（miR-320a、miR-665、miR-1275、miR-3184-5p、miR-3185、miR-3195、miR-4459、miR-4640-5p、miR-6076和miR-6717-5p）表达水平构建了卵巢癌诊断模型并表现出了理想的灵敏度（99%）和特异度（100%）；在Ⅰ期卵巢癌患者诊断中，准确率甚至高达95.1%。可见，miRNA及其组合在卵巢癌诊断中具有较高的灵敏度、特异度，有望应用于卵巢癌的早期诊断。但目前有关研究大多为回顾性，因此其诊断效能仍需在大规模的前瞻性研究中进一步验证。2.2.2 长链非编码RNA 长链非编码RNA（lncRNA）是一类不具备蛋白质编码能力的RNA，长度大于200 nt。目前已注释的人类lncRNA近60 000个。研究表明，lncRNA与包括卵巢癌在内的多种癌症有关，表达模式往往具有高度组织特异性和疾病特异性，因此具备作为卵巢癌诊断生物标志物的潜力。CHANG等研究发现，高表达的HOTAIR通过负性调控miR-206的表达刺激卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭，进而增强CCND1和CCND2的表达。lncRNA HOTAIR过表达也与卵巢癌组织学分级、FIGO分期及广泛转移相关，此外HOST2、TUG1、H19、SNHG12等异常高表达在卵巢癌进展中也发挥作用。lncRNA MALAT1在卵巢癌细胞中异常高表达，其通过海绵吸附miR-143-3p调控CMPK表达，促进卵巢癌侵袭、转移。但是在卵巢癌细胞中也有部分lncRNA呈低表达，如TUBA4B、MEG3、XIST等。LONG等也报道lncRNA Gas5在卵巢癌组织中明显低表达并与预后相关，且Gas5-E2F4-PARP1-MAPK轴在卵巢癌进展中发挥重要作用。2.2.3 环状RNA 环状RNA（circRNA）是一类具有共价封闭结构的单链环状非编码RNA。与线性RNA相比，circRNA具有不含5'端和3'端的结构特征，使其更加稳定、保守、高丰度。这些独特的特性也使circRNAs成为研究热点之一。在卵巢癌中，异常的circRNA可以在转录或转录后水平调控基因表达，从而介导卵巢癌细胞增殖、侵袭、转移、免疫逃逸和耐药等多种恶性生物学行为，有望成为卵巢癌的生物标志物和治疗靶点。XIE等报道，circEPSTI1可通过海绵吸附miR-942上调EPSTI1的表达，然后激活Wnt/β-catenin信号通路，从而促进卵巢癌细胞增殖。另有多种circRNA也在卵巢癌中展现了较好的诊断价值，如circ-ABCB10、circMAN1A2等。PEI等也发现，has_circ_0013958在卵巢癌组织和细胞系中高表达且与FIGO分期和淋巴结转移密切相关；has_circ_0013958作为卵巢癌诊断标志物的灵敏度为80.0%、特异度为91.1%、AUC为0.912。TENG等采用高通量测序分析21例上皮性卵巢癌和21例正常卵巢组织中的circRNA表达谱，共发现7 333个circRNA，其中circHIPK3是含量丰度最高的分子之一，有望成为诊断卵巢癌新的生物标志物。因此，NGS技术推动了circRNA研究进一步发展，未来将会有越来越多的circRNA被发现。
2.3 ctDNA
2.3.1 血浆ctDNA ctDNA是指肿瘤细胞死亡或破裂后释放出来的遗传物质，主要存在于肿瘤患者的循环系统中。1977年，研究人员首次在癌症患者的血液中发现ctDNA。ctDNA通常由70~200 bp的短核酸片段组成，可能携带与原发肿瘤相似的基因改变和突变，目前已被用于检测肿瘤特异性突变、杂合性缺失、DNA完整性、启动子过甲基化、微卫星改变和表观遗传改变。ctDNA还可以克服肿瘤的异质性，反映人体的肿瘤负荷，及时反映患者病情，是一种很有前景的生物标志物。LIGGETT等报道，卵巢癌患者血浆中ctDNA的RASSF1A、CALCA和EP300等3个基因启动子甲基化在鉴别卵巢癌患者与健康人群具有较高的灵敏度（90％）和特异度（86.7％）。深度测序技术为检测血浆中少量的DNA提供了技术支持。NEBGEN等通过深度测序技术检测出等位基因频率2%突变的灵敏度和特异度均高于97%，表明ctDNA检测在非侵入性技术方面具有独特优势。COHEN等还开发了基于血液的肿瘤早筛技术CancerSEEK，其诊断卵巢癌的灵敏度和特异度分别为98%、99%。这是一种能检测常见ctDNA突变基因和8种蛋白质生物标志物的非侵入性的血液检测方法，但目前尚处于试验阶段，其有效性尚需进一步验证。随着技术检测和研究方法的改进，未来ctDNA检测有望在卵巢癌的早期诊断中取得突破进展。2.3.2 血浆线粒体DNA 释放入血的肿瘤DNA根据核基因和核外基因分为核DNA （nuclear DNA，nDNA）和线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）。其中，人类mtDNA是存在于线粒体基质内由11个mRNA，22个tRNA和2个rRNA（16S，12S）以及调控转录和翻译的非编码区——D环（displacement loop，D-loop）区组成的一个总长为16 569 bp的环状双链DNA分子，相对于nDNA，mtDNA具有母系遗传、基因组小、高拷贝数、高突变率等特点，在细胞代谢、生物合成、衰老、凋亡等过程中发挥至关重要的作用。点突变是肿瘤细胞中最常见的mtDNA变异，而mtDNA D-loop控制区包含mtDNA复制起始点和转录启动子，不仅是mtDNA转录复制的调控区，而且是mtDNA突变的热点区域。刘首娟等在93例卵巢癌患者中发现60例（64.5%）D-loop区突变，其中突变位点73A/G和523C/del增加了卵巢癌的发病风险，突变位点366G/A和411C/G也可能与卵巢癌发病密切相关，且D-loop区突变联合CA125检测可提高卵巢癌的早期诊断准确性（灵敏度为79.49%~100.00%）。由此可见，mtDNA具有作为卵巢癌诊断标志物的潜能。2.3.3 宫腔灌洗液ctDNA 卵巢癌脱落细胞会聚集在宫颈处，利用巴氏试验获取的宫腔灌洗样本可检测到足够量的肿瘤DNA。因此认为，该法有望成为卵巢癌早期诊断的途径。MARITSCHNEGG等通过大规模平行测序分析65例患者（卵巢癌30例、良性肿瘤27例、其他恶性肿瘤8例）的宫腔灌洗样本ctDNA，发现在60%卵巢癌患者样本ctDNA中可检测到突变，且以TP53突变为主；进一步利用微滴式数字PCR技术检测，突变率提高至80%；其中在ⅠA期患者样本ctDNA中均检测到TP53突变，但良性肿瘤患者均未检测到TP53突变。在液体活检中，深度测序被认为是检测肿瘤低水平突变特征的首选方法。其中，双链测序（duplex sequencing，DS）能将错误率降低到十万分之一以下，是目前测序准确率最高的NGS测序方法。SALK等使用DS检测宫腔灌洗液中ctDNA TP53突变，其对卵巢癌检测的灵敏度为80%，但在健康女性样本中也检测到低频的TP53突变。因此，为了避免假阳性结果，可用突变等位基因频率阈值区分癌症特异性变化和年龄相关突变，相信随着技术的进一步发展，宫腔灌洗的分子分析将在卵巢癌早期诊断中展现更大的潜力。
2.4 TEP
TEP RNA谱也有望成为卵巢癌诊断的肿瘤标志物。肿瘤细胞通过直接接触和外泌的释放将生物分子（如 RNA）转移到血小板，从而改变血小板前体RNA。在肿瘤细胞和肿瘤微环境的刺激下，血小板前体mRNA剪切成成熟的RNA并转化为功能性蛋白以应对外界刺激，最终形成TEP。在肿瘤发生发展过程中，TEP RNA表达谱发生变化，使其具备成为肿瘤生物标志物的潜能。而TEP作为生物标志物具有三大优点：一是血小板作为人体内无核细胞器，不受基因组DNA干扰；二是实验室操作易于标准化；三是TEP RNA谱可反映肿瘤细胞的病理过程，提高肿瘤早期诊断的灵敏度。PIEK等研究发现TEP可作为鉴别早期（Ⅰ~Ⅱ期）卵巢癌与良性卵巢肿瘤的诊断指标，准确率达80%。也有研究报道TEPs和ctDNA/CTC的组合分析是潜在的癌症诊断方法。目前以评估TEP和ctDNA鉴别卵巢肿瘤准确性的临床试验（NCT04022863）也正在进行中，结果值得期待。
03
小结
肿瘤标志物检测是临床上常用的早期卵巢癌筛查诊断的手段，但是单独检测传统标志物CA125和HE4都有一定局限性，联合多种标志物检测可以提高诊断效能。近年来液体活检技术发展迅速，在卵巢癌早期筛查诊断、动态检测、精准化治疗中扮演了越来越重要的角色，展现了广阔的应用前景。相信随着液体活检检测技术和研究方法的不断改进，未来将会挖掘更多特异度、灵敏度更高的新型肿瘤标志物，从而助力卵巢癌早期诊断。
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